蛋白质泛素化定量分析很难？我们总结了这些要点！

生物体内的绝大多数蛋白质都是在发生了翻译后修饰后起作用的。如人体中有50%以上的蛋白质发生了翻译后修饰，目前已经确定的翻译后修饰有400多种，但对这些翻译后修饰的研究还不够深入。

科技君近期先后对磷酸化、乙酰化、糖基化等几种蛋白质翻译后修饰的组学研究进行了分享；此次，将针对泛素化蛋白质翻译后修饰进行相关介绍。

不断革新和成熟的质谱技术，为更多的蛋白质泛素化研究提供了有利工具。近十年来，泛素化研究文章数量（关键词ubiquitination）高达50,000+，蛋白质泛素化研究已然成为蛋白质翻译后修饰（PTMs）中的研究热点之一。

图1 PubMed“ubiquitination”文章发表情况

什么是泛素化修饰？

泛素化修饰是蛋白翻译后修饰中的一种，指的是泛素（Ubiquitin）通过E1-E2-E3的级联反应连接到靶蛋白的赖氨酸残基上，泛素化涉及8种不同的泛素链连接类型（M1、K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63），其中K11和K48连接的泛素链会优先被蛋白酶体降解。泛素化蛋白可以通过泛素依赖性的蛋白酶体快速地去除。蛋白质泛素化分析可应用于动物、植物、微生物等各个研究领域，在细胞周期、信号传导、细胞内转运、蛋白质互作、转录调节、蛋白降解等过程中发挥关键作用。

在蛋白质组水平上对泛素化进行定性定量研究有助于更进一步了解生物体内蛋白质泛素化状态和特定泛素化位点的改变，从而达到研究生物体内泛素化蛋白质组动态变化与表型改变之间关系的目的。

蛋白质泛素化定量分析

泛素化修饰的蛋白被胰酶消化后，在其赖氨酸的修饰位点上会产生两个甘氨酸的残基（K-GG），泛素化修饰肽段可被赖氨酸泛素化抗体富集，之后采用基于timsTOF Pro质谱仪的4D label-free非标记定量方法，实现对泛素化蛋白的定量分析。

应用方向

肿瘤病变

植物发育、抗逆等

衰老及退行性疾病、免疫炎症等

了解完蛋白质泛素化定量分析，让我们再结合几篇代表性案例来解锁它在各个研究领域中的应用吧！

案例分享

案例1 - 肿瘤病变方向

文章：A cancer ubiquitome landscape identifies metabolic reprogramming as target of Parkin tumor suppression.^[1]

研究背景：

肿瘤作为人类健康的“头号杀手”，通过重组细胞代谢适应不利微环境从而促进疾病的发展。Parkin是一种E3泛素连接酶，它可能在调节癌细胞代谢和抑制肿瘤生长方面发挥作用。

研究方法：

泛素化蛋白质组学、蛋白质组学、western-blot等。

研究成果：

通过蛋白组学和泛素化蛋白组学检测，发现了通用肿瘤抑制机制：E3泛素连接酶Parkin，通过干扰癌细胞重新编程其代谢的能力来拮抗恶性细胞增殖和转移能力。

图2 Parkin抑制肿瘤的原理模型

文献链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abg7287

案例2 - 衰老等疾病方向

文章：Rewiring of the ubiquitinated proteome determines ageing in C. elegans.^[2]

研究背景：

泛素化是真核生物最普遍的蛋白降解途径之一，通过对蛋白进行泛素化标记，被细胞内相应的酶识别、降解（此过程可被去泛素化酶DUB逆转）。以往研究证实泛素化几乎参与一切生命活动调节，但其对衰老的影响尚不清楚。

研究方法：

泛素化蛋白质组学。

研究成果：

1）衰老过程中的泛素化蛋白质组发生重塑；

2）伴随年龄增长，去泛素化酶抑制蛋白泛素化；

3）随着年龄的增长，蛋白酶体靶标降解受阻，影响线虫寿命；

4）对寿命决定因子IFB-2和EPS-8生物学功能解析。

图3 随着年龄增长泛素化蛋白质组发生重塑

文献链接：https://www.nature.com/articles/s41586-021-03781-z

案例3 - 植物生长发育方向

文章：Advanced Cataloging of Lysine-63 Polyubiquitin Networks by Genomic, Interactome, and Sensor-Based Proteomic Analyses.^[3]

研究背景：

在真核细胞中会发现许多不同的泛素链类型，分辨率不高一直是我们了解其具体作用的主要障碍。lys-63（K63）连接的泛素链是植物细胞中第二丰富的泛素形式，但我们对其细胞和生理功能知之甚少。

研究方法：

转录组学、泛素化蛋白质组学。

研究成果：

1）经质谱分析鉴定到约400个K63多泛素修饰的蛋白；

2）UBC35/36催化K63泛素化，对植物生长发育至关重要；

3）揭示了K63多泛素修饰调节网络通过调控生物及非生物胁迫响应、物质代谢、微管运输、跨膜转运、染色体结构、RNA剪切等过程影响拟南芥的生长发育。

图4 拟南芥K63泛素化修饰蛋白组的分离与分析

文献链接：https://doi.org/10.1105/tpc.19.00568

欢迎垂询

蛋白质泛素化定量分析首先采用赖氨酸泛素化特异性抗体富集泛素化肽段，再通过液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）进行检测。

华大基因使用CST抗体高效富集泛素化肽段，随后在timsTOF Pro平台上采用4D label-free方法进行蛋白质泛素化定量。4D label-free蛋白质组学提高了离子利用率和鉴定准确度，以更少上样量、更快扫描速度，全面提升蛋白质组学的覆盖深度、灵敏度、通量。

产品优势↓↓↓

质量保证：采用进口金标抗体，高标准修饰富集操作，数据结果稳定可靠；

鉴定数高：4D技术可有效区分修饰同分异构多肽，提高定量的准确性、鉴定数，更适合微量样本。

部分测试结果↓↓↓

1. 鉴定深度：采用10mg水稻苗蛋白质，鉴定到2,690+泛素化肽段。

2. 定量准确性：采用10mg小鼠肝蛋白进行泛素化定量研究，操作重复间定量相关性>0.94。

注：sample10_1和sample10_2为10mg起始量的两次操作重复。

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邮箱：[e-mail]

参考文献：

[1] A cancer ubiquitome landscape identifies metabolic reprogramming as target of Parkin tumor suppression. Sci Adv. 2021 

[2] Rewiring of the ubiquitinated proteome determines ageing in C. elegans. Nature. 2021

[3] Advanced cataloging of lysine-63 polyubiquitin networks by genomic, interactome, and sensor-based proteomic analyses. Plant Cell. 2020

供稿：Carol

编辑：市场部

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